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    2017年, 第31卷, 第5期
    刊出日期:2017-09-10
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    烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成途径和水稻叶片早衰
    陈平, 吴立文, 王忠伟, 张宇, 郭龙彪
    2017, 31(5): 447-456.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7028 447
    摘要 ( )   HTML ( )   PDF(64362KB) ( )  

    叶片是植物进行光合作用的主要场所,其衰老由内源遗传发育信号和外界环境胁迫所启动,是一个非常复杂有序的调控过程。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)是脱氢酶的辅酶,在糖酵解、糖异生、三羧酸循环以及呼吸链等代谢中发挥着不可替代的作用。最新研究表明,水稻NAD生物合成参与调控沉默信息调控因子Sirtuins的生物活性、组蛋白H3K9去乙酰化、植物激素茉莉酸(JA)和叶片衰老。本文综述了有关水稻叶片衰老的细胞生理特征、Sirtuins酶活、NAD生物合成以及水稻早衰的OsSRT1-NAD调控途径和OsSRT1-MeOH-JA调控途径,以期阐明水稻叶片衰老的分子机理及其调控途径,为高产育种提供相应的理论参考。

    水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF7.9在氮素积累和转运中的 功能研究
    冯慧敏, 陆宏, 王汉卿, 李昕玥
    2017, 31(5): 457-465.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7031 457
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    目的 植物NPF家族成员具有转运硝酸盐、小肽等的功能。对水稻OsNPF7.9基因的功能研究能够为水稻氮素高效利用的分子机制提供理论基础。方法 利用不同的生物软件对OsNPF7.9蛋白的生物学信息进行了预测分析;用OsNPF7.9基因启动子融合GUS报告基因的转基因水稻进行OsNPF7.9的组织定位观察;利用半定量RT-PCR和pOsNPF7.9::GUS转基因水稻分析OsNPF7.9受氮素调控特征;构建了OsNPF7.9的超表达水稻株系,并进行生理指标测定。结果 OsNPF7.9是细胞质膜蛋白,有12个跨膜结构域,在第6~7个结构域之间有一个大的亲水环。组织定位结果显示OsNPF7.9在根、叶片、根茎结合处和花中都有表达。RT-PCR和pOsNPF7.9::GUS转基因水稻的GUS染色结果都表示,OsNPF7.9的表达不受氮素形态和浓度的影响。OsNPF7.9基因超表达后,不仅显著增加水稻的地上部硝酸盐含量以及根系向地上部的硝酸盐转运,而且增加了地上部的总氮浓度、总氮积累以及根系向地上部的总氮转运。结论 OsNPF7.9参与硝酸盐从根系向地上部的转运,并且OsNPF7.9超表达可以提高水稻氮素积累和转运能力。

    控制水稻金黄色颖壳与节间基因OsCAD2的图位克隆
    王宏, 张迎信, 孙廉平, 孟帅, 徐鹏, 吴玮勋, 程式华, 曹立勇, 沈希宏
    2017, 31(5): 465-474.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.6170 465
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    目的 水稻色素不仅对其自身生长发育有重要生理作用,而且在水稻育种、农副产品改良等方面运用比较广泛。对水稻色素相关基因进行表型分析和基因定位,为进一步研究色素代谢途径及调控机理奠定基础。方法 利用EMS诱变粳稻长粒粳(CLJ),在突变体库内筛选到一个金黄色颖壳与节间突变体gh881;在成熟期,测定野生型与gh881的主要农艺性状;将gh881与野生型及中恢8015杂交,观察BC1F1及F1植株表型,并对BC1F2及F2表型分离进行卡方检验,对gh881进行遗传分析;利用F2群体和图位克隆的方法对gh881突变基因进行定位;采用qPCR检测颖壳颜色相关基因在gh881与野生型不同发育时期的幼穗、节间以及剑叶叶鞘的相对表达量。结果 与野生型相比,突变体的颖壳与节间均呈金黄色;除单株有效穗数外,gh881突变体的株高、每穗总粒数及实粒数、结实率和千粒重等性状均极显著降低。遗传分析和基因定位结果表明,gh881的突变表型受1对隐性核基因控制,位于第2染色体短臂,并最终将该基因精细定位于标记FH-13和RH-25之间,物理距离约33.2 kb,该区域中包含4个开放阅读框(ORFs)。结论 序列分析结果表明,发现其中一个编码肉桂醇脱氢酶(CAD)的基因OsCAD2(Os02g0187800)的 3 563 bp处发生了1个单碱基突变(G转换为A),导致该基因编码区的第297位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸,由此认为该突变体为OsCAD2基因单碱基突变的新等位基因。qRT-PCR结果表明,突变体的节间中OsCAD2相对表达量极显著下调,而在剑叶叶鞘及穗部则基本都是极显著增加,其他相关基因也发生显著变化,证实OsCAD2是木质素代谢中的重要基因,且可能与其他相关基因存在反馈调节。

    水稻着丝粒特异组蛋白CENH3抗体的制备与应用
    薛超, 张融, 郭瑞, 刘帅, 刘晓宇, 沈明晨, 邓世峰, 龚志云
    2017, 31(5): 475-482.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7036 475
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    目的 着丝粒是真核生物染色体的基本功能元件之一,其功能是在细胞有丝分裂和减数分裂时期精确地调控染色体配对和分离并维持染色体的稳定。着丝粒结构是由DNA和蛋白质形成的一种复合体。着丝粒特异组蛋白(centromere-specific histone H3, CENH3)是功能着丝粒是否具有活性的最基本特征。所以制备CENH3的相关抗体是进行着丝粒结构与功能研究的前提条件之一。方法 通过设计短肽进行兔免疫实验,制备了水稻着丝粒特异组蛋白CENH3兔源抗体,利用ELISA和蛋白免疫荧光(immunofluorescence, IF)等检测方法对抗体有效性进行了鉴定。结果 ELISA检测显示制备的CENH3抗体有效稀释度为1: 40万,并且蛋白免疫荧光信号在水稻体细胞每条染色体的着丝粒区域均能检测到。同时,该抗体也可以应用于玉米等其他物种。通过染色质免疫沉淀(ChIP)技术获得与CENH3相结合的DNA分子,并进行PCR扩增和FISH定位分析,结果显示相应的ChIP-DNA位于水稻功能着丝粒区域。结论 本研究制备的水稻CENH3兔源抗体能满足着丝粒研究中相关实验的要求,可进一步应用于着丝粒的结构与功能研究。

    一个水稻小热休克蛋白的异源表达及寡聚特性分析
    蔡年俊, 郭留明, 李静, 项聪英, 羊健, 陈剑平, 张恒木
    2017, 31(5): 483-488.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7010 483
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    目的 在前期研究中,本实验室已克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),并发现该基因的表达明显受到热激和病毒侵染调控,表明该蛋白可能在逆境胁迫过程中起重要作用。本研究的目的在于进一步明确OsSHSP17.6的特性。方法 在本研究中,进一步将该基因亚克隆至原核表达载体pET-32a并导入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysS诱导表达,通过亲和层析的方法纯化了该重组蛋白,进一步用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析。结果 异源表达的重组OsSHSP17.6能减轻IPTG对宿主菌的毒害。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析显示纯化的重组OsSHSP17.6蛋白在体外能形成同源二聚体和寡聚体。结论 这些结果支持OsSHSP17.6是一个有功能的分子伴侣蛋白并表明该蛋白可能通过形成同源寡聚体的方式参与逆境胁迫反应,这为进一步明确OsSHSP17.6的功能机制奠定基础。

    水稻淡绿叶基因PGL11的鉴定与精细定位
    涂政军, 邹国兴, 黄李超, 陈龙, 代丽萍, 高易宏, 冷语佳, 朱丽, 张光恒, 胡江, 任德勇, 高振宇, 董国军, 陈光, 郭龙彪, 钱前, 曾大力
    2017, 31(5): 489-499.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7043 489
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    目的 叶片是水稻进行光合作用的主要场所,叶片颜色的变化与水稻的生长发育直接相关。发掘水稻叶色突变体,是水稻功能基因组学研究的重要遗传基础。方法 利用EMS诱变日本晴获得一个能稳定遗传的淡绿叶突变体,暂命名为pgl11(pale green leaf 11)。在不同生育期测定野生型与突变体的叶绿素含量。在苗期,取野生型与突变体叶片进行叶绿体结构的透射电镜观察。在分蘖期,测定野生型与突变体的光合参数并观察气孔结构。在成熟期,测定野生型和pgl11的主要农艺性状。以pgl11为母本,南京6号为父本构建相应的F2群体,采用图位克隆的方法,对该基因进行定位。结果 从苗期开始,突变体pgl11的每一片新叶均表现为淡绿色,叶绿素含量显著降低,叶绿体发育异常。随着叶片的生长,叶色由淡绿逐渐转绿,至抽穗期时叶绿素含量亦无明显差异。pgl11还表现光合速率、气孔导度明显下降,胞间CO2浓度上升。扫描电镜观察发现,突变体pgl11的气孔发育异常。与野生型相比,突变体的农艺性状如株高、剑叶宽、二次枝梗数、每穗粒数、粒长、粒宽、千粒重以及结实率等均显著降低。对叶绿素合成、光合作用以及质体发育相关基因的表达量测定表明,突变体pgl11中参与叶绿体转录和翻译相关基因的表达量显著升高,而叶绿素合成和光合作用相关基因的表达量显著下降。遗传分析表明,该突变表型受一对隐性核基因控制。通过图位克隆的方法将该基因定位于第1染色体上的C6和C8标记之间,物理距离约为110 kb。结论 该定位区间内未见有叶色相关基因报道,推测PGL11基因可能是一个新的水稻叶色基因。

    水氮管理对不同氮效率水稻根系性状、氮素吸收利用及产量的影响
    李娜, 杨志远, 代邹, 孙永健, 徐徽, 何艳, 蒋明金, 严田蓉, 郭长春, 马均
    2017, 31(5): 500-512.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.6145
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    目的 探究水氮管理措施对不同氮效率水稻根系构型、氮素吸收利用和产量形成的影响,以及根系性状特征与氮素吸收利用和产量关系。方法 试验采用三因素裂裂区设计,主区为2个不同氮效率水稻品种德香4103(氮高效型)和宜香3724(氮低效型),裂区设置“常规灌溉”和“控制性交替灌溉”2种水分管理方式,裂裂区为SPAD指导施肥、优化施肥以及农民习惯施肥3种施氮模式,运用岭回归分析方法探究根系构型与氮素吸收利用和产量的关系。结果 水稻抽穗期根系性状、产量、每穗粒数、千粒重及总颖花量均存在显著的基因型差异。氮高效品种德香4103每穗粒数多,群体库容量大,产量较氮低效品种宜香3724高0.24%~11.31%;控制性交替灌溉有利于水稻千粒重的增长,常规灌溉则对水稻有效穗数、每穗粒数及群体颖花量提高更为有利;SPAD指导施肥和优化施肥处理能够提高水稻有效穗数和每穗粒数,扩大群体颖花量以保证其对农民习惯施肥的产量优势;由于水氮互作效应的存在,控制性交替灌溉下施氮处理与空白处理水稻千粒重的差距比常规灌溉的大幅降低,使得控制性交替灌溉下施用氮肥的增产效果更佳。德香4103的氮肥生理利用率较宜香3724平均高8.69%,常规灌溉下水稻氮积累量较高,控制性交替灌溉下氮肥回收率、农学利用率、生理利用率均较优;与农民习惯施肥处理相比,SPAD指导施肥与优化施肥模式更有利于水稻氮素吸收利用效率的提高。拔节期、抽穗期和成熟期水稻根系构型与产量岭回归方程的决定系数范围为0.4198~0.9028,其中,抽穗期根系性状与产量关系最为密切,氮高效和氮低效品种的决定系数均超过0.9。在拔节期,水稻细分枝根长对产量影响最大;在抽穗期,氮高效和氮低效品种存在差异,前者是粗分枝根长,后者是细分枝根表面积对产量影响最大;在成熟期,不定根长与产量关系最为密切。水稻抽穗期根系构型对氮积累量变化的解释程度较高,岭回归方程决定系数均接近0.7。就水氮管理措施而言,氮高效和氮低效水稻均应采用常规灌溉配套SPAD指导施肥或控制性交替灌溉结合优化施肥来实现产量的提高。结论 水稻抽穗期根系构型与产量、氮积累量关系密切,采用合理的水氮管理措施能够实现水稻产量和氮素吸收利用效率的同步提高。

    灌溉模式与施氮量交互作用对水稻产量以及水、氮利用效率的影响
    褚光, 陈婷婷, 陈松, 徐春梅, 王丹英, 章秀福
    2017, 31(5): 513-523.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7048 513
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    目的 研究不同水、氮管理模式对水稻产量以及水、氮利用效率的影响,以期为水稻高产与水、氮高效利用提供理论依据和技术参考。方法 大田试验于2015–2016年在浙江富阳进行,供试品种为三系籼型杂交稻天优华占。设置常规灌溉(CI)和干湿交替灌溉(AWD)两种灌溉模式,同时设置低氮(LN, 80 kg/hm2)、中氮(MN, 160 kg/hm2)和高氮(HN, 240 kg/hm2)3种施氮水平。结果 灌溉模式与施氮量对水稻产量以及水、氮利用效率有显著互作效应。与CI相比,AWD抑制无效分蘖,分蘖成穗率提高8.1%~10.7%;提高抽穗期至成熟期的光合势(LAD)与群体生长率(CGR);促进根系下扎,10~20 cm根层根系生物量增加了24.4%~32.3%,同时提高了结实期根系活性;促使茎鞘中非结构性碳水化合物(NSC)向籽粒中运转;且AWD在160 kg/hm2(中氮)施氮水平下可显著提高产量与水、氮利用效率,为本研究最佳的水、氮运筹模式。结论 通过适宜的水、氮运筹可充分发挥其互作效应,提高水稻产量与水、氮利用效率。

    开放式空气中CO2浓度和温度增高对水稻叶片叶绿素含量和SPAD值的动态影响
    周宁, 景立权, 王云霞, 朱建国, 杨连新, 王余龙
    2017, 31(5): 524-532.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7022
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    目的 针对不断增高的大气二氧化碳(CO2)浓度和温度,研究这两个重要环境因子及其互作对大田生长水稻叶片叶绿素含量和SPAD值的动态影响。方法 利用农田T-FACE(Temperature-Free Air CO2 Enrichment)系统,以高产优质粳稻武运粳23为供试材料,设置两个CO2浓度(环境CO2浓度和高CO2浓度)和两个温度处理(环境温度和高温),测定自然生长环境下水稻不同生育期叶片的叶绿素含量及SPAD值。结果 550 µmol/molCO2浓度使水稻移栽后41、77、94 d叶绿素a,b和a+b含量均增加(最大增幅为6.4%),但移栽110、119 d后均减少(最大降幅为5.4%)。由于叶绿素b含量对CO2较叶绿素a含量更敏感,故高CO2浓度使移栽后41、77和94 d叶绿素a/b值均下降,降幅分别为4.7%、2.3%和0.9%,但移栽110和119 d后分别增加1.9%和5.3%;以上对CO2的响应多达显著水平。对叶片SPAD值而言,高CO2浓度对水稻生长前、中期的影响较小,但移栽110和119 d后分别下降3.5%(P=0.1)和19.1%(P<0.01)。大田生长期增温1℃,各期叶绿素a、b以及a+b含量多呈增加趋势,叶绿素a/b值表现相反,但总体上变幅小于CO2效应;高温对水稻前、中期叶片SPAD的影响较小,但移栽110和119 d后SPAD值平均下降7.1%和14.8%,均达极显著水平。CO2与温度处理对上述测定参数多无显著互作效应,但CO2浓度、温度处理与生育期之间多存在明显的互作效应。结论 大气CO2浓度增高有利于水稻生长前中期叶片叶绿素的形成,但生长后期叶绿素含量和SPAD值均明显下降且伴随叶绿素a/b值的显著升高,这种早衰现象在不同生长温度下趋势一致。

    褐飞虱热激蛋白70在不同温度胁迫下的差异表达特性研究
    单丹, 王利华, 张月亮, 韩阳春, 牛洪涛, 潘磊, 方继朝
    2017, 31(5): 533-541.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.6171 533
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    目的 褐飞虱是我国主要水稻害虫之一,随着全球气候变暖,其越冬范围逐年扩大。为了明确褐飞虱对温度的适应机制,研究了其热激蛋白70基因家族的组成及温度诱导表达特性。方法 利用转录组测序和GenBank数据库获取热激蛋白70基因序列,采用MEGA4.1邻接法构建进化树,利用实时荧光定量PCR研究其温度诱导表达特性。结果 筛选出与热激蛋白70基因同源性较高且具有完整开放阅读框的序列共15个,其中8个在正常或温度胁迫下表达,可能分布在细胞质/细胞核、内质网、线粒体等器官,且本身表达丰度存在显著差异。30~44℃高温胁迫后KX976471、KX976473、KX976475、KX976476、KX976477和KX976478等6个基因的表达量不同程度上调,最大上调倍数为1.72~245.33;0~22℃低温胁迫后,除KX976475表达量上调2.38倍外,其余基因表达量变化不显著或下降。结论 褐飞虱8个热激蛋白70基因在正常或温度胁迫下表达,可能分布于细胞质/核、线粒体、内质网;在其高温适应性中可能起重要作用,但在低温适应性中的作用有限。

    ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析
    冯向阳, 张震, 柴荣耀, 邱海萍, 王教瑜, 毛雪琴, 王艳丽, 孙国昌
    2017, 31(5): 542-550.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.7018
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    目的 真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。方法 采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。结果 MoMET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因MoMET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。MoMET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。结论 无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。

    水稻对穗枯病的抗病机理初步研究
    李路, 徐以华, 梁梦琦, 王玲, 刘连盟, 侯雨萱, 黎起秦, 黄世文
    2017, 31(5): 551-558.  DOI: 10.16819/j.1001-7216.2017.6167 551
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    目的 水稻在孕穗期比苗期更容易感染穗枯病(Bacterial panicle blight of rice)并出现病症。本研究旨在探究水稻不同时期对穗枯病的抗性机理,为培育抗病水稻品种奠定基础。方法 采用喷雾法和注射法分别对苗期和孕穗期的抗、感病水稻品种接种颖壳伯克氏菌(Burkholderia glumae),测定处理组与对照组的3种抗氧化酶(POD、CAT、SOD)活性的差异,并利用实时荧光定量PCR测定5种防卫反应基因(PR1aPR10bRchtLOXPAL)的表达量。结果 B. glumae的侵染能引起水稻活性氧的积累,提高抗氧化酶活性,使部分防卫反应基因大量表达,但是苗期和孕穗期的应答有较大区别。水稻孕穗期的抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性和防卫反应基因(PR10bRchtPAL)的表达量比苗期高,但PR1aLOX的表达量却低于苗期。结论 B. glumae能诱导孕穗期的水稻产生更多抗病反应,参与抗病反应的主要是水杨酸信号传导途径。